13003243133
13911112151
HT-SCZ04型高通量垂直电泳槽
SSR非变性胶实验说明
1.1 微卫星引物
根据 Röder（1998）、Pestsova（2000）和Gupta（2002）等提供的小麦微卫星引物序列合成引物，筛选并应用于本项研究的具多态性的小麦SSR引物。
1.2 PCR 反应体系
每个PCR反应体系为25ul，其中含50ng 基因组DNA，2.5mM Mg2＋，200uM dNTPs，1U Taq DNA 聚合酶和 0.25uM 微卫星引物。详细反应体系见下表：
1.3 PCR 扩增体系
反应条件为 95℃ 5min，随后94℃1min，50、55或60℃（依引物的退火温度而定）50sec，72℃ 1min，循环35次，最后在72℃延伸5min。具体步骤为（以引物退火温度55℃为例子，退火温度随所用引物而异）：
1.5 PCR 产物电泳
1.5.1 电泳准备
灌胶
将硅化好的玻璃板，用文具夹固定，放置在一个平台上，注意要将玻璃板底部悬空，以免未凝的胶液流出，凝胶灌胶时要保持玻璃板的水平面，将配制的胶液沿着凹口处灌入胶板（浓度配比见附录）。将胶液灌至凹板的凹口处，插入样品梳，注意不要带入气泡。
如果使用专用制胶器操作如下(进行普通SDS-PAGE蛋白电泳需分别灌制分离胶浓缩胶适用)
1、 用制胶器中的凝胶板固定夹，将玻璃板固定，注意此时要确保玻璃板底部平齐。
2、 将固定好的凝胶板置于制器上，旋紧上部两侧的两个螺栓，使压板向下压住玻璃板，确保底部的密封。
3、 分别灌入分离胶、浓缩胶，并插入梳子。
待凝胶充分凝固后，拔下梳子，卸下玻璃固定夹，将凝胶板固定到电泳槽上
在等待凝胶凝固的过程中可先将电泳槽与低温循环器接，电泳的侧面有上下两个水口，下面的水口为进水口，上面的为出水口，如同时使用多台电泳槽，可依次将多台电泳槽串接起来。
胶凝后，用自来水清洗玻璃板的外面，把胶板垂直放在电泳槽上。用夹子把玻璃板与电泳槽两边夹住。
加样
先打开低温循环器，将电泳槽降温，时间大约10分钟左右。在电泳槽的上下槽倒入1XTBE，轻轻拔下梳子，不要损坏点样孔，将拔下的梳子用清水冲洗。即可向点样孔内加样。注意要先倒缓冲液后拔梳子，如果反过来操作会容易产生气泡。
点样时可使用八道排**加样，节省时间，使用八道排枪加样时，注意如果是102齿梳子，是每隔两个孔点一个样品。68齿梳子是每隔一个孔点一个品，样品上样量为2-2.5μl，Marker上样量1.5μl。
102齿 68齿
聚丙烯酰**非变性胶的配制：
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8%聚丙烯酰**凝胶工作液配方 |
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总体积 |
10 |
20 |
30 |
40 |
50 |
60 |
70 |
80 |
90 |
100 |
110 |
120 |
130 |
140 |
150 |
160 |
170 |
180 |
190 |
200 |
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dH2O |
7 |
14 |
21 |
28 |
35 |
42 |
49 |
56 |
63 |
70 |
77 |
84 |
91 |
98 |
105 |
112 |
119 |
126 |
133 |
140 |
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10×TBE |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
13 |
14 |
15 |
16 |
17 |
18 |
19 |
20 |
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40%丙烯酰** |
2 |
4 |
6 |
8 |
10 |
12 |
14 |
16 |
18 |
20 |
22 |
24 |
26 |
28 |
30 |
32 |
34 |
36 |
38 |
40 |
|
TEMED(ul) |
10 |
20 |
30 |
40 |
50 |
60 |
70 |
80 |
90 |
100 |
110 |
120 |
130 |
140 |
150 |
160 |
170 |
180 |
190 |
200 |
|
10%AP(ul) |
100 |
200 |
300 |
400 |
500 |
600 |
700 |
800 |
900 |
1000 |
1100 |
1200 |
1300 |
1400 |
1500 |
1600 |
1700 |
1800 |
1900 |
2000 |
1.5.2 扩增产物的电泳
扩增产物：在扩增产物中加入4ul Loading buffer。
加入变性的扩增样品DNA2-3ul，恒压130-330V，根据引物的不同来确定，电泳约60-90min（视SSR分子量大小及差异带型的可辨程度调整电泳时间）。HT-SCZ04C型恒压可可恒至400V。
电泳结束后，小心分开两块玻璃板，将胶剥离下来，等待染色。
1.5.3 扩增产物的银染显色
（1）漂洗：在塑料盘中加入200ml蒸馏水漂洗1次，再加入200ml蒸馏水。
染色：加入2ml 10％AgNO3 (10g AgNO3加入到100ml蒸馏水中)后，平行摇动5～8min。
（2）漂洗：倒掉定影液，加入蒸馏水漂洗2～3次，洗净后，倒掉蒸馏水。
（3）显色：在塑料盘中加入200ml 1.5％溶液（3gNaOH加入200ml蒸馏水中）和1ml甲醛，
迅速振动，使显影液均匀作用，然后平行摇动，直至显影。
（4）洗涤：清楚显影后，倒掉显影液，加入蒸馏水清洗凝胶1～2次，彻底去掉显影液，以
免保存时变色。
（5）保存：用蒸馏水冲洗干净，放在胶片上吸干水，上面盖上保鲜膜，统计带型，并照相
或扫描。
（以上为染2-4块胶的用量，如果染色的胶块数目为6-8块，以上用量加倍），银染液和显色液可重复使用2-3次，显色液含有甲醛，用后应及时倒掉。
1.5.4 药品的配制
0.5M EDTA（pH8.0）：181.1g Na2EDTA-2H2O溶于800ml水中，用固体NaOH调pH值至8.0，定容至1000ml，高温灭菌，室温保存。
10×TBE Buffer：
搅拌溶解，定容至 2000ml，温室保存。
40％－Acrilamide 胶储备液：380g丙烯酰**和20g N',N’-亚甲双丙烯酰**加ddH2O定容至1000 ml，4 ℃保存。过滤后置于 4℃备用。
10％过硫酸铵（Ammonium Persulphate）：
溶解后，各管分装 250ul，-20℃保存。
Loading Buffer：
溴酚蓝0.15g 二甲苯青0.25g 蔗糖30—40g 加水定容至100ml，4℃保存。